酵母单杂交预期结果和解释

在酵母单杂交筛选中,使用单个的DNA-诱饵可以发现0~40个相互作用蛋白。通常,大的、复杂性高的DNA诱饵如启动子将获得更多的蛋白分子,而转录因子结合位点或者小的顺式作用元件通常仅获得一个或几个相互作用蛋白。大多数(>95%)获得蛋白为转录因子,但是没有可预测的DNA结合域的蛋白质仅占相互作用的少数(<5%), 这些蛋白质可能具有一个新型的DNA结合结构域或者间接与DNA-诱饵作用,由于酵母单杂交捕获蛋白含有很强的激活结构域,因此,激活子和抑制基因都能够被发现,相互作用分子的功能需要用其他实验进行检测。
酵母单杂交相互作用的评价
特征 说明
相互作用发现的频率 如果一种相互作用出现了多次,那非常令人振奋,但是,也不能排除它是单个克隆的重复,特别是当这些蛋白质表现出特定的表达方式和水平时。
诱饵蛋白具有弱的自激活活性 如果筛选到的克隆中报道基因的激活明显高于背景时,可以认为它具有与诱饵蛋白相互作用的可能性。
诱饵蛋白自激活活性非常高 在这种情况下要对发现的相互作用非常慎重,获得假阳性的可能性很高。
过缺刻修复对猎物进行验证 这对减少假阳性非常必要,除非用含基因编码序列/cDNA的克隆进行验证,经验证后的相互作用是真实的,除非诱饵蛋白具有弱的/强的自激活活性。
相位 确保猎物与Gal4 AD的编码序列相位一致,如不能,将是假的多肽赋予了相互作用的表型。