酵母双杂交常见问题

问题1：转化不能够产生酵母克隆。

解决方案:由于转化效率依赖于酵母的健康状态，在各步都不要用力混匀，确保所有的感受态在室温下进行操作，由于待转化质粒DNA的数量和质量也很重要，在进行转化前检测质粒的质量和浓度,通常新制备的质粒有利于转化。
问题2:PCR不能扩增DNA片段。

解决方案:根据我们的经验，用cDNA进行的PCR失败的最常见原因是由于目的分子不在其中，这可能是由于基因产物不正确，与真实的基因不匹配。或者是由于收集转录物时mRNA没有表达，因此目的分子在cDNA中丢失，不同类型的或者发育时间点的组织可能是目的cDNA的更好来源。模板丢失的另一个原因是转录物太长，反转录不能产生全长的cDNA。如果基因产物不正确，可以考虑使用其他的引物扩增其他的区域，或者先使用RACE以确定转录物的5'端和3端。
问题3: 转化效率低。

解决方案:高效的转化效率应当达1X 10%/mg DNA (环状的)，如果出现的克隆太少，注意酵母的转化效率是否严重受到酵母生长状态的影响，因此，只用新鲜生长的酵母株，不要振荡，确保所有的溶液保存在室温下。由于待转化质粒的数量和质量也非常重要，制备DNA时应当使用乙醇沉淀以去除污染物，DNA 浓度应当用分光光度计进行测定。如果根本没有克隆生长，很可能培养液不正确(如葡萄糖没有加入、溶液的交叉污染)。
问题4:没有蓝斑产生。

解决方案:如果在37'C孵育24h后，酵母裂解物没有产生任何蓝斑，可能是缺少或错配了其中的一种试剂。最可能的原因是Z-缓冲液的pH不是7.0, X-gal 浓度正确且状态良好也是重要的原因。要检测上述试剂是否有问题，最简单的办法是用已知能表达不同水平β-gal的酵母菌株作为对照，进行检测。
问题5:酵母在硝酸纤维素膜上生长较差或不生长。

解决方案:酵母在膜上生长缓慢或不生长通常是由于从绒布上转移的效果较差所致。这通常是由于使用的平板是在2天之内配制的，使用时培养基仍然潮湿，而潮湿会抑制酵母从绒布转移到膜上。有两种方法可以使培养基充分干燥，一是在通风橱里取下盖子干燥20min,二是把它们(盖上盖子)在台子里放置一个星期。酵母从绒布上转移较差的另一个原因是绒布上原本就没有足够的酵母，从选择性培养基上转移酵母到绒布上时确保按紧压实，确保硝酸纤维素膜/YAPD平板是从新制备的绒布上转移的第一个或第二个平板。检查硝酸纤维素膜上是否有成功转移的酵母是一个可行的办法，硝酸纤维素膜在30℃多孵育一天，酵母就可以生长到一个足够用于检查的数目。
问题6:酵母克隆的PCR未见条带。

解决方案:除了影响PCR的常规因素外( 如操作遗漏、DNA降解或试剂配错等)，还需要考虑酵母克隆的PCR的一些特殊因素。首先，酵母应该被zymolyase高效裂解以释放出PCR模板，zymolyasc 是一种酶，因此需要放在冰上且反复冻融不能超过3次，此外，zymolyase是悬液，因此需要间歇地混合(每隔30s)以避免样品裂解不均匀。第二个需要考虑的因素是加入太多酵母菌会抑制PCR反应，如何决定合适的酵母量，一种有效的方法是加入不同量的酵母到zymolyase中以明确合适的酵母量。