杂交系统中有两种类型的假阳性在系统中,“技术假阳性”是无法重复出来的，而“生物假阳性”在酵母中很容易检测到，但体内却是不发生的。判定相互作用是否是生物学假阳性是一件很具有挑战性的事，因为用于体内验证的实验也有其局限性或假阴性率。例如，它可能难以或者不可能验证低丰度蛋白质生化反应或瞬态/低亲和力蛋白之间的相互作用。然而，可整合其他类型实验的数据以确定PPI或PDI的可靠性，这点非常有用。例如，当几个蛋白质在同一细胞中表达、在同一亚细胞定位且同时表达时，那么它们之间的PPI就可能非常真实。

如果操作得当，酵母杂交系统的技术假阳性率很低。有几个重要的问题需要考虑。首先，最重要的技术假阳性来源于蛋白质或DNA-诱饵蛋白的高度自激活，也就是说，它在缺乏一个AD捕获子的情况下仍然能够激活报道基因表达。一些诱饵为“天然”自激活因子，也就是说，所有的诱饵酵母显示出统一且高度的报道基因激活能力(例如，许多TF有自己的AD，这些AD本身在酵母中就具有功能)。然而，一些诱饵可以转化为新的自激活因子，也就是说，一些来源于同一群体的普遍自激活水平较低的单个酵母，由于PCR (最初克隆诱饵时)突变或者在酵母的繁殖突变而显示出高自激活水平。当自发的自激活因子发生在筛选过程中时，它们均显示为阳性菌落。然而，当用新鲜的含诱饵的酵母细胞重新在菌落中检测AD-捕获子时，相互作用就不能重复出来。因此，重复检测以避免PDI和PPI这种类型的假阳性是至关重要的。在Y1H系统中，将DNA-诱饵整合到酵母基因组中以确保固定拷贝数及固定背景的报道基因表达是至关重要的。总之，虽然可能出现技术上假阳性,但通常可以利用在新鲜的诱饵酵母细胞中重复测试相互作用以消除之。