免疫共沉淀实验流程

一、实验原理
免疫共沉淀实验的实验原理如下图所示,首先,用编码诱饵蛋白及其相应配体--靶蛋白的质粒转染细胞,再用去污剂裂解细胞,得到了含有诱饵靶蛋白复合物以及些不相关蛋白。向细胞裂解产物内加入特异性识别诱饵蛋白的捕获抗体,从而形成一种抗体-诱饵靶复合物。惰性琼脂糖小珠可与蛋白A共价偶联结合。而蛋白A又可稳定地结合到许多抗体的稳定区上,因此,利用这种抗体便可使蛋白复合物固定在惰性琼脂糖小珠上。而那些没有与小珠结合的蛋白则被不断地洗脱掉。最后,诱饵-蛋白复合物再从小珠上洗脱下来,接着可在SDS中煮沸使它们解离。最后再采用Western blot来检测有无靶蛋白。
co-ip原理
二、材料与仪器
1.HEK293细胞系
2.细胞培养基及培养箱
3.胰酶/EDTA: 0. 25%胰酶/ 0. 1% EDTA溶于HBSS
4. PBS液: 130 mmol/L NaCl, 20 mmol/L磷酸钠,pH 7.5。
5.细胞裂解液
6.捕获抗体。
7. Protein A Sepharose 4 Fast Flow
8.洗脱液: 150 mmol/L NaCl, 10mmol/L HEPES, pH 7. 5 , 0.2% Igepal CA - 630或NP-40,4℃保存。
9.50 mmol/L HEPES, pH7.5, 4℃保存。
10.非还原的2XSDS缓冲液: 120mmol/L Tris- HCl, pH 6.8,3.3% SDS, 10%甘油,40μg/ml 溴酚蓝。
11.还原型的2 X SDS缓冲液:非还原型的2 X SDS缓冲液加入200mmol/L二硫苏糖醇。
12. SDS - PAGE, Western blot 装置。
13.用于Western blot的一抗。
14.用于Western blot的辣根过氧化物酶偶联的二抗
15.ELC试剂
16.胶片及相关的显影成像装置
三、方法
1.裂解细胞
我们首先谈如何制备细胞裂解混合物,这可作为诱饵蛋白复合物的来源。用编码目的蛋白的质粒转染细胞后,让其充分表达蛋白。接着从培养皿中取出细胞,PBS洗两遍并计数。最后,用温和的去垢剂裂解细胞,再用Western blot来检测目的蛋白。
1.1选择样品
(1)在进行一项新的免疫沉淀实验时,最好让表达的诱饵蛋白和靶蛋白都融合两个不同亲和标签(如下表)。因为这些标签目前应用范围较广,很寻常。故在进行Western blot 或确定 捕获抗体时变得很容易。这种方法也有利于降低成本。减少一些特殊试剂的使用,因为同一个抗体可用于多种实验。
标签名称 标签序列 抗体名称
EGFP 蛋白质 A.v.肽抗体
FLAG DYKDDDDK 抗-FLAG(M2)
HA YPYDVPDYA 12CA5
myc EQKLISEEDL 9E10

(2)还必须注意的是,免疫沉淀所检测到的两种蛋白质相互作用的特异性如何。因此设立阴性对照非常有用,可有助于说明这个问题。除双转染细胞外,还应取少量的未转染或单独转染(诱饵或靶)细胞一起测试。假若事先能预测这两种蛋白相互作用的结构域,也可用突变蛋白来进行验证。另外一个有用的对照是进行相互免疫沉淀实验(即免疫沉淀原始靶蛋白并寻找共沉淀的诱饵)。
1.2转染
(1)构建蛋白表达载体,以及一些突变或带标签的变异体的表达载体。
(2)用构建好的诱饵蛋白和靶蛋白表达载体对2个35mm培养皿的HEK293细胞进行瞬时转染。也可用六孔板的两个孔细胞进行实验。转染方法可采用常用的磷酸钙沉淀法或脂质体转染方法。
(3)培养细胞24~48小时,让其充分表达蛋白。收细胞时其融合度尽可能达到80%~100%。
1.3搜集细胞
(1)单纯从方法学角度来说,并不需要严格消毒,然而对细胞、培养基以及细胞裂解液均要考虑无生物公害,应采取必要的处理措施。
(2)收集被转染细胞的培养基到一个离心管内。
(3)向每盘细胞内加入1ml PBS并轻柔摇数下,收集PBS及残留的培养基。
(4)再向每盘细胞内加入300pl胰酶/EDTA,于37°C孵育,直到细胞从培养皿上脱离下来。这对于HEK293细胞来说需要的时间很短。用枪反复吹打使细胞不要成团聚集,接着将细胞转移到含培养基和PBS液的离心管内。
(5)经离心(500g, 5min), 细胞沉淀到管底呈为小块状,弃去上清。
(6)加入2ml PBS轻柔重悬细胞(采用低速旋涡震荡)。
(7)取20μL细胞悬液做计数用,并将其置于冰上。
1.4裂解细胞
(1)从这一步起,细胞及其裂解液均应保持在4℃。
(2)再次离心细胞(500g, 5min, 4℃),弃上清。
(3)加入600μL细胞裂解缓冲液(一般情况下,35mm的培养皿用300μL)后反复吹打或旋涡振荡,这可能会出现许多泡沫,置于冰上30min充分裂解细胞。
(4)这期间可对上述留取的细胞进行计数。对于两个35mm的HEK293细胞培养皿,其细胞密度在生长接近融合时大约为1X10*6/ml 。
(5)可采用离心的方法(14 000g, 10min, 4℃)去除没有被裂解的细胞、细胞核和碎片。从而将上清转移至干净的小管内。
(6)这样便可将其长期保存于-70℃冰箱。
1.5评价蛋白表达情况
用针对诱饵蛋白和靶蛋白的抗体去检测膜上的蛋白。如果经Western blot 没有检测到所有的目的蛋白,就应终止实验。此外,每盘细胞其裂解产物内所含的目的蛋白的量应该相等。通常可采用反复转染来解决这个问题,也可以通过对所用DNA量、转染后细胞的培养时间进行适当调整或更换其他细胞系。
2.免疫沉淀
以下主要描述从细胞裂解产物里如何分离、纯化诱饵-靶蛋白复合体。第一步是预清除(preclearing), 其目的是从细胞裂解产物里除去那些直接与蛋白A琼脂(protein A sepharose, PAS)基质直接结合的蛋白。在没有抗体存在下,将细胞裂解物与PAS一起孵育,接着结合有蛋白的PAS被去除。在用另外一份PAS沉淀前,所想要的蛋白及与其相互作用的蛋白接着被结合到捕获抗体上。最后,含有一些液体的蛋白在经过一系列清洗后也得以移除。
2.1对细胞裂解物的预清除
(1)使用前,PAS应用裂解缓冲液进行冲洗。每个样品大约需要110 μL 50%的PAS贮存悬液。使用微量离心机快速离心5~10秒,使PAS沉淀,吸弃上清。加入等体积的细胞裂解缓冲液,通过轻弹管底重悬小珠。重复2~3次使其充分混悬,使其成为含有50%PAS的细胞裂解悬液。
(2)将相当于8X105个细胞的裂解产物稀释至300μL,并装入1.5 ml的微离心管内,加入50μL已清洗过的50% PAS。
(3)于4℃轻柔旋转混匀PAS/细胞裂解物1小时。转动的力量应足以保持PAS处于悬浮状态,但应同时避免不要让气泡产生。
(4)经离心(14 000g, 1min, 4℃)使PAS沉淀。转移上清(即为已预清除过的裂解产物)到一个干净小管内。注意不要带有PAS,可弃之。
2.2诱饵蛋白-抗体复合物的形成
(1)在免疫沉淀的过程中,蛋白都是保持其天然、折叠的构象,而在Western blot时它们都已变性。用于免疫沉淀的抗体不能通过Western blot的结果去预测抗体的效果和特异性。捕获抗体并不需要在Western blot中能识别出其靶蛋白或仅显示出单个条带。通常根据文献或厂家提供的实验指南来选择捕获抗体。
(2)对预清除过的细胞裂解物里加入1-5μg捕获抗体。
(3)于4℃轻柔旋转摇匀,1.5小时,使捕获抗体与诱饵蛋白充分结合形成复合物。
2.3沉淀抗体
(1)向裂解物/抗体混合液里加人50μL已洗过的50%PAS。
(2)轻柔旋转摇匀(4C, 1. 5小时),注意要能保持小珠处于悬浮状态。
2.4清洗
(1)通过简单离心(小离心机5~10秒),使结合有抗体以及相关蛋白复合物的PAS沉淀。小心去除上清,因为PAS小块很容易被打散,故可保留少量(大约10~20μL)的上清没过小珠。
(2)于4℃,加入500μL洗脱液到PAS,轻弹管底或来回颠倒使PAS小珠重悬,如第一步离心弃上清。重复两次,共三次清洗。操作要快,整个过程均应在4℃环境中进行。
(3)加入500μL的50mmol/L HEPES, pH 7.5,到PAS小珠里,使其再次重悬,再同第一步快速离心沉淀PAS,但要尽可能去除上清。低离子强度的HEPES缓冲液有助于防止产生SDS-PAGE过程中的凝胶假象。
3.分析沉淀下来的蛋白
在这一部分里,诱饵复合物在SDS里煮沸并变性,并从PAS上游离下来。再对这些蛋白经SDS-PAGE,Western blot来检测有无靶蛋白。
3.1蛋白质洗脱
(1)洗脱缓冲液的选择,假若诱饵或靶蛋白的大小为20-30kD或50-60kD,就应选择非还原型的2 × SDS样品缓冲液;否则使用还原型的2 × SDS液。
(2)加入25μL洗脱缓冲液到已清洗过的小珠,稍稍振荡使其重悬,盖紧小管的帽,并于100"C孵育5min。实验前应测试实验所用的小管在加热过程中帽是否会爆开,因为这有时可导致样品的丢失。
(3)以14000g室温下离心5min,沉淀PAS。室温下离心很重要,有助于防止SDS沉淀。转移20μL上清于干净的小管中,小心不要吸到PAS,用过的PAS可以弃之。
(4)有时在进行本实验前,也可将样品存于≤一20°C 冰箱。但在融化后,在进行SDS - PAGE前应该再次于100°C加热。
3.2 SDS-PAGE及Western blot
(1)使用标准方法经SDS-PAGE分离样品,并将蛋白转移到膜上。
(2)对膜上所想要的靶蛋白进行检测,尽可能保证用于Western blot的一抗与捕获抗体的属源不同。并同时检测免疫沉淀下来的诱饵蛋白来决定是否有大致相同量的靶蛋白存在。