膜体系酵母双杂交载体选择攻略

膜体系酵母双杂选择载体是根据诱饵蛋白质定位的不同来选择，有利于互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16相互作用，被UBPs识别，从而启动下游报告基因表达。那么膜体系有哪些载体？具体要如何选择？下面小正给您支支招。

1、膜体系有哪些诱饵载体？

膜体系酵母双杂交有三种诱饵载体，分别如下：

pBT3-N

pBT3-SUC

pBT3-STE

2、如何选择载体?

根据蛋白结构域的不同，选择的载体有所区别，下表中我们总结了不同情况下适合选择的载体。

蛋白结构域	选择载体名称
N端位于胞质	pBT3-N
C端位于细胞器腔内（或者胞外）
C端位于胞质	pBT3-SUC
N端位于细胞器腔内（或者胞外）,且N端含有信号肽
C端位于胞质	pBT3-STE
N端位于细胞器腔内（或者胞外）,且N端不含信号肽
N端位于胞质	pBT3-N或pBT3-STE
C端均位于胞质

那么怎么预测蛋白的结构域呢？具体预测流程如下：

1、CDS序列翻译为氨基酸序列

https://www.novopro.cn/tools/translate.html

2、蛋白跨膜结构域预测

https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0

3、蛋白信号肽预测

https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0

4、蛋白结构域预测

http://smart.embl-heidelberg.de/

三、膜体系筛库交付标准?

什么样的膜体系筛库结果是合格的呢？小正带您直观体验膜体系筛库的交付金标准，以使用pBT3-STE筛选膜体系文库为例，共计七大步骤和七大结论。

1、诱饵载体构建

结论1：通过一代测序比对载体是否正确。

2、诱饵载体功能验证

结论2：构建的诱饵载体是否存在移码突变，泛素特异性蛋白酶系统功能是否可以正常发挥功能，是否进行后续筛选实验。结果显示可以进行后续筛选试验。

3、自激活及毒性检测

结论3：诱饵载体pBT3-STE-XXX是否存在自激活，是否可以后续筛选实验。结果显示可以进行后续筛选试验。

4、酵母文库初筛

结论4：通过初筛共筛选到多少个单克隆。

5、对初筛结果进行复筛

结论5：通过复筛共筛选到多少个阳性克隆。

6、回转验证

结论6：对酵母阳性克隆质粒进行回转验证，确定有多少个真阳性基因。

7、点板验证

结论7：（可依据文章需求，进行个性化展示）确定是否跟回转验证结果一致。